Expressão de genes de resistência a inseticidas em Anopheles darlingi Root, 1926 (Diptera: Culicidae) de Coari-AM, em condições de estresse químico / Mellina Vilhena Naice.

Dissertação (mestre) - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA, 2010

A malária ou impaludismo é uma das infecçoes que causa mais mortes no mundo e é um dos problemas mais importantes de saúde pública. Cerca de 3,5 bilhoes de pessoas que vivem nos trópicos estao expostas a essa infecçao pelos agentes etiológicos da malária, cuja taxa de incidência varia de 350 a 500 milhoes de casos por ano, levando a óbitos cerca de 1,5 a 2,7 milhoes habitantes. O mosquito Anopheles darlingi é o principal vetor da malária neotropical, especialmente na Amazônia, onde ocorre a maioria dos casos da doença. Nos últimos anos, os casos de malária têm diminuído cerca de 24,7% na regiao e um dos motivos é o uso de inseticidas sintéticos em anofelinos, tal como o inseticida Deltametrina. Nesse sentido, estudou-se o A. darlingi de Coari-AM, visando contribuir para o seu conhecimento na resposta contra o piretróide Deltametrina frente ao nível de expressao dos genes Glutationa S-Transferase (GST), Acetilcolinesterase (AChE), Superóxido dismutase (SOD), Troponina Isoforma 3 e Citocromo P450. Para isso, verificou-se a expressao diferencial destes genes em relaçao ao gene constitutivo Actina e GAPDH em amostras de A. darlingi expostas a diferentes concentraçoes de Deltametrina. A partir de vários testes de bioensaios com diferentes diluiçoes do inseticita (0,05%; 0,025%; 0,0125%; 0,00625%; 0,009375%, 0,003125 e 0,001562%) observou-se que as melhores concentraçoes para realizar os bioensaios foram de 0,025% (soluçao letal regulamentada pela WHO), 0,003125% e 0,0015625%. Realizou-se os bioensaios para as concentraçoes de 0,025%; 0,003125% e 0,0015625% e os adultos sobreviventes desses bioensaios foram mantidos a 80 ºC negativos. Extraíram-se o RNA total de um pool 20 indivíduos de A. darlingi pelo método do Trizol(R). O RNA total extraído foi quantificado em gel de agarose 0,8%, corado em brometo de etídio e visualizado sob aparelho Eagle eye de luz ultravioleta. Sintetizaram-se a fita complementar de RNAm, com o kit First Strand cDNA Synthesis (#K1611, #K1612 da Fermentas TM). Tanto o DNA genômico como o cDNA de amostras de A. darlingi foram utilizado para padronizar a amplificaçao dos primers, pelo método da PCR clássica. A partir do método da qRT-PCR os primers amplificados foram o gene alvo GST e o gene constitutivo GAPDH, utilizando-se o sistema SYBR-Green(R) em aparelho de StepOnePlus PCR em Tempo Real e analisados pelo método (delta delta)C T. Nas concetraçoes de 0,025%; 0,003125% e 0,0015625%, verificou-se que a mortalidade foi de 46%, 20% e 25%, respectivamente. Nas análises de PCR em Tempo Real, houve expressao do gene GST quando comparado ao gene GAPDH, tanto em 1 hora como de 8 horas. A diferença encontrada na expressao gênica nos intervalos de tempo para as três concentraçoes de Deltametrina foi: na concentraçao de 0,025% a expressao de 1 hora foi 50% maior do que a expressao de 8 horas; na concentraçao de 0,003125% a expressao de 1 hora foi 33% maior do que a expressao de 8 horas e na concentraçao de 0,0015625% nao pode realizar a comparaçao, já que as amostras de 8 horas nao amplificaram via PCR em Tempo Real. Porém, nao foi possível determinar a expressao dos transcritos AChE, Troponina Isoforma 3 e SOD, em relaçao à Actina e GAPDH, porque os primers desses genes nao amplificaram satisfatoriamente. A amplificaçao diferencial das enzimas GST e GAPDH mostrou indícios de que A. darlingi seja resistente ao inseticida Deltametrina e que o gene GST é um excelente indicador genético de resistência a esse inseticida.

Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.