Clonagem e expressão regulada do cDNA da glicoamilase de Aspergillus awamori em Pichia pastoris / Edson Júnior do Carmo.

Dissertação (mestre) - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA, 2010

A utilizaçao de produtos biotecnológicos, especialmente proteínas e enzimas no setor industrial, tem aumentando significativamente em nível mundial. A glicoamilase é uma das principais enzimas responsáveis pela hidrólise do amido para a formaçao de xarope de glicose, matéria-prima utilizada pela indústria de alimentos e como fonte de carbono em processos fermentativos diversos. A levedura metilotrófica Pichia pastoris tem sido utilizada com sucesso para expressao de várias proteínas de interesse biotecnológico. O objetivo deste trabalho foi avaliar o sistema de expressao heteróloga utilizando a levedura P. pastoris para a produçao da enzima. O cDNA da glicoamilase isolado do fungo Aspergillus awamori 2B 361 U2/1 foi inserido no genoma de P. pastoris utilizando o vetor de expressao pPIC9, baseado no promotor AOX, gerando clones recombinantes de fenótipos Mut+ e MutS cultivados sob agitaçao constante para a produçao e secreçao da proteína. As atividades das enzimas foram avaliadas utilizando o método DNS que quantifica açúcares redutores resultantes da clivagem das moléculas de amido. A máxima atividade enzimática observada no sobrenadante bruto do clone com fenótipo Mut+ foi 7.7 U/mL e do clone transformante MutS foi 6.9 U/mL. Os dois clones secretaram glicoamilases com 116 kDa que apresentaram diferentes poder catalítico, mas foram bioquimicamente semelhantes, com mesma temperatura de atividade ótima a 60ºC, elevada açao catalítica em pH ácido que varia de 4.5 a 2.5 com atividade máxima em pH 3.5 e suas estabilidades frente ao pH do meio de reacional, possuindo portanto, características desejáveis para uso em alguns processos bioindustrias. Ambos os produtos se mantiveram estáveis quando os extratos brutos foram incubados a temperatura de 4Cº por 60 dias, mantendo perto de 100% da atividade máxima. No entanto, a enzima produzida por P. pastoris Mut+ apresenta maior estabilidade térmica, retendo cerca de 70% de atividade residual quando incubada por 60 minutos a 60Cº, contra menos de 10% de atividade residual observada para a enzima expressa pelo clone MutS, avaliada nas mesmas condiçoes. Diferentes modificaçoes pós-traducionais poderiam estar envolvidos na pronunciada diferença de estabilidade térmica das proteínas produzidas por P. pastoris que tem se mostrado um excelente sistema de expressao de proteínas.

Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.